本作はニューヨークの自然史博物館が舞台。失業中でバツイチのラリーは、愛する息子の信頼を取り戻すために博物館の夜警として働くことになるのだが、早速居眠りしてしまう。
ラリーが目覚めると、なんと博物館内のティラノザウルスの骨格が動き出す。恐竜に追いかけられ、モアイ像にからかわれ、ミニチュア人形に囚われるなどラリーは散々な目に遭うが、テディ・ルーズベルト大統領のろう人形に助けられなんとか一晩をやり過ごす。
その後、博物館ガイドのレベッカの助けを得て2日目の夜に向けて猛勉強を開始。しかしその夜も、猿のデクスターのイタズラのせいで館内は大変なことに…。クビになりそうなところを許してもらったラリーは、動き回る展示物を見せようと息子のニッキーを夜の博物館に呼ぶことに。その影ではラリーが予想もしていない陰謀が動き始めていた…というストーリー。
主人公のラリーを演じているのは『メリーに首ったけ』や『ミート・ザ・ペアレンツ』のヒットで人気となると、自ら監督、脚本、製作も手掛けた『ズーランダー』シリーズや、ドリームワークスの人気アニメシリーズ『マダガスカル』の声優、また数々のアクション映画のパロディが話題となった『トロピック・サンダー／史上最低の作戦』などで知られるベン・スティラー。
ろう人形のルーズベルト大統領役には『グッドモーニング, ベトナム』『フィッシャー・キング』『ミセス・ダウト』でゴールデングローブ賞に、『グッド・ウィル・ハンティング／旅立ち』ではアカデミー助演男優賞に輝いたほか『ジュマンジ』などの数多くの作品に出演しているロビン・ウィリアムズ。
監督には『リアル・スティール』『インターンシップ』などでメガホンを取り、『メッセージ』などでは製作として名を連ねるショーン・レヴィ。
彼とともに『ホーム・アローン』をはじめ『ハリー・ポッター』シリーズや『ピクセル』などコメディからファンタジー、SFまで様々なスタイルの作品を世に送り出してきたクリス・コロンバスが製作を手掛けている。
金曜ロードSHOW！『ナイトミュージアム』は7月26日（金）21時～日本テレビ系で放送。
